滨松单相机双色同步成像解决方案_滨松光子学商贸(中国)有限公司

滨松单相机双色同步成像解决方案

郑一哲（zyz@hamamatsu.com.cn）

使用灵活之随意更换滤光片

W-View GEMINI允许使用者自行更换其中的滤光片以灵活适应于各种颜色/波长之间的分光需求。其中的滤光片尺寸为显微镜中常用的标准尺寸，最大限度地方便研究者对于滤光片的挑选使用。（有关W-View GEMINI灵活使用的 "详细解说视频" ，不仅包含更换滤光片的操作，而且包含分光模式/By-pass模式切换操作以及光路校正操作的介绍演示）

使用灵活之W-View读出模式

采用W-View GEMINI这样的双色分光附件将两种颜色的信号成像到一台相机的一个感光芯片上很好地解决了同步成像的时间问题，但对于绝大多数的相机，整个感光芯片只能设置一个曝光时间，当两个颜色的信号强度相差较大时将很难同时将两个颜色的成像信噪比保证在最佳状态。

而滨松Flash 4.0系列sCMOS相机则可以分别调整同一芯片上下两半的曝光时间，称为W-View读出模式。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0系列sCMOS相机的时候，我们可以非常灵活地调整两个颜色信号的相对亮度，得到更加能够突出所需信号和结构的图片。在两个颜色通道的信号差别非常大的时候，Flash 4.0系列sCMOS相机 + W-View GEMINI这种灵活的曝光时间设置就可以针对不同的波长设置不同的曝光时间，同时保证两个波长信号的信噪比。（有关W-View读出模式以及整套解决方案的 "详细解说视频" ）

应用之双色同步高速成像

滨松W-View GEMINI双色分光器可以将显微镜下同一个样品的信号按照波长分别成像到同一台相机的两边，配合高速高灵敏度的Flash 4.0系列sCMOS相机就可以做到非常高速的双色同步成像。下面这个例子中（ Nature Methods (2014) 11:919-922 ），作者在300-500帧/秒单层光片(lightsheet)成像的基础上，实现了针对斑马鱼心脏的3D高速光片双色成像。滨松高速高灵敏度的sCMOS相机Flash 4.0和双色分光器W-View GEMINI 被用于这一套"high-speed SPIM"系统中。对于高速高灵敏度的Flash 4.0 sCMOS相机，作者在文章中专门提到： "… Our data demonstrate that the high acquisition speed of SPIM with modern sCMOS cameras (400 fps for 512 × 512 pixels) is key for optimal 3D reconstructions of the beating heart."

下面这个应用实例则是希望通过Di-4-ANEPPS这个染料对iPS心肌细胞的膜动作电位进行成像。Di-4-ANEPPS这种荧光染料通过蓝光（~48 8nm）激发，其发射波长却会根据膜电位而有所变化，通过计算细胞不同区域内525 nm/630 nm的比值就可以得到此区域内膜电位的变化。这种成像方法相相对膜片钳等电生理方法而言，可以得到细胞任意位置的膜电位变化，空间分辨率更高。而W-View GEMINI双色分光附件以及高速高灵敏度的Flash 4.0 sCMOS相机的应用也保证了其极高的时间分辨率（每秒100个数据点），使得我们可以对细胞任意位置的动作电位进行时间空间都非常精确的测量。

应用之明场-荧光同步成像

在显微成像中，有时会希望能够对荧光和明场进行完全同步的成像。例如在下面所示的例子中，斑马鱼尾部血管中的部分血细胞被标记了绿色的荧光。为了区分清楚同时处于高速运动状态的被标记细胞和普通细胞，以及看清楚其具体的行为，我们不仅需要高速采像，而且需要完全同步地拍摄到样品荧光和明场的图像；否则对于这样高速运动的样品，先拍一张明场再拍一张荧光就很难做到细胞的一一对应。而为了达到这些要求，我们采用红光进行明场的拍摄，这样W-View GEMINI双色分光器就可以将红色的明场信号及绿色的荧光信号分光并成像到相机芯片的两边（参见下右的光路示意图），实现完全同步地荧光和明场成像。实验中滨松Flash 4.0 LT sCMOS相机不仅能够实现400帧/秒的高速拍摄，而且其高灵敏度保证了对应的2.5 ms曝光时间下荧光图片的清晰（ "详细解说视频" ）

而在下面这个例子中，研究者同步拍摄监测了心肌细胞波动时的钙离子浓度变化以及细胞收缩的情况。蓝光激发发绿色荧光的Fluo-8被用于钙离子浓度的监测，而明场的相差（phase contrast）成像则是采用了600-680 nm的红光。通过对单个细胞中钙离子浓度和相差图像的分析，可以看出钙离子的浓度上升是稍稍领先于心肌细胞的收缩的。

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应用笔记：双色同步成像

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