单分子蛋白TIRF-FRET双色同步成像
本网页为滨松绝对量子产率分析仪Quantaurus-QY在实际使用中的FAQ。
|
|
所用相机：
Flash 4.0 (C11440-22CU) & W-View GEMINI双色分光器
显微物镜：
Apo TIRF 100x Oil NA1.49
成像方法：
单分子TIRF-FRET双色同步成像
拍摄条件：
曝光时间100ms
|
|
此实验采用TIRF照明是为了排除溶液中大量悬浮荧光分子的影响，提升所需观察的单分子荧光的信噪比。测试样品为标记了Alexa 488和Alexa 647两个荧光集团的蛋白，所以采用488nm的激光作为激发光光源时，会产生共振能量转移（FRET）使能量从被激发的Alexa 488转移到Alexa 647上，我们在连续的拍摄中可以发现同一个位置Alexa 647发出红色荧光，Alexa 488被激发发出的绿色荧光。实验采用了双色分光器W-View GEMINI，使得实验中可以实时完全同步地监测Alexa 488和Alexa 647所发出绿光和红光的信号；而Flash 4.0的灵敏度以及100ms的曝光时间使得我们可以观察到微观世界里的单分子行为。
|
|
此外，在针对cy3、cy5标记的的样品的测试中，我们还观察到过典型的发生FRET的"交互型"现象——由于分子构象发生变化，Cy3、Cy5的距离改变，Cy3与Cy5的荧光信号也随之变化（如下图）。且随着光漂白，信号整体呈下降趋势。
|