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单分子成像:背照式sCMOS相机及双色分光器的应用

# 单分子的弱信号成像需求——高灵敏度相机


单分子成像信号较弱,为了减小背景荧光(来自细胞的自发荧光等等)的影响,一般会采用TIRF技术+相机进行成像。同样由于信号弱,单分子成像对相机的需求较高,传统上采用EMCCD等相机。


近些年来,随着sCMOS技术的持续发展,sCMOS相机除了更高的帧速、更多的像素数目、更高的分辨率,在灵敏度/信噪比上也逐渐提升。对于STORM等基于单分子成像的超分辨技术,从2015年左右开始就逐渐采用了滨松Flash 4.0等第二代sCMOS相机以获得更好的帧速、分辨率。


而2020年发布的FusionBT低噪声背照sCMOS相机,在信噪比上进一步提升,对于单分子成像中信号较弱的场景也有了足够的灵敏度。


案例1. FusionBT sCMOS相机的单分子成像案例。荧光探针为TagRFP。此案例采用了双色成像,相关方案参考"滨松单相机双色同步成像方案示意"。(建议将视频调至超清模式观看)



案例2. YFP标记的膜蛋白单分子TIRF成像。示FusionBT sCMOS相机与EMCCD相机的成像效果对比。(建议将视频调至超清模式观看,点击此处,还可观看1080P更高清画质的原视频)


# 单分子的双色同步成像需求——双色分光器:单相机方案&双相机方案


单分子成像经常与FRET技术联用,用于在单分子层面研究分子的构造变化(如蛋白质分子domain之间的距离变化等等)。由于FRET技术需要同时对两个波长同时监测采像,所以一般会在相机和显微镜之间加装双色分光器,通过二向色镜/滤光片按照波长将信号分开,并分别成像。滨松提供单相机双色同步成像和双相机双色同步成像等两套方案,前者成本较低,后者则有更大的视野范围以及更多扩展功能(如物镜后焦面成像、PSF修饰等)。


单相机双色同步成像方案


滨松单相机双色同步成像方案示意。W-View GEMINI双色分光器将不同颜色的光信号按波长分别投射到同一台相机芯片的两半上。


 

案例3. 作者采用滨松sCMOS相机与W-View GEMINI双色分光器配合得到了最高2ms时间分辨率的单分子FRET成像,分析了核糖体pre-translation complex的动力学结构变化。Curr Opin Chem Biol. (2014) 20:103-111


双相机双色同步成像方案



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