单分子成像：背照式sCMOS相机及双色分光器的应用

郑一哲（zyz@hamamatsu.com.cn）

# 单分子的弱信号成像需求——高灵敏度相机

单分子成像信号较弱，为了减小背景荧光（来自细胞的自发荧光等等）的影响，一般会采用TIRF技术+相机进行成像。同样由于信号弱，单分子成像对相机的需求较高，传统上采用EMCCD等相机。

近些年来，随着sCMOS技术的持续发展，sCMOS相机除了更高的帧速、更多的像素数目、更高的分辨率，在灵敏度/信噪比上也逐渐提升。对于STORM等基于单分子成像的超分辨技术，从2015年左右开始就逐渐采用了滨松Flash 4.0等第二代sCMOS相机以获得更好的帧速、分辨率。

而2020年发布的FusionBT低噪声背照sCMOS相机，在信噪比上进一步提升，对于单分子成像中信号较弱的场景也有了足够的灵敏度。

案例1. FusionBT sCMOS相机的单分子成像案例。荧光探针为TagRFP。此案例采用了双色成像，相关方案参考"滨松单相机双色同步成像方案示意"。（建议将视频调至超清模式观看）

案例2. YFP标记的膜蛋白单分子TIRF成像。示FusionBT sCMOS相机与EMCCD相机的成像效果对比。（建议将视频调至超清模式观看，点击此处，还可观看1080P更高清画质的原视频）

# 单分子的双色同步成像需求——双色分光器：单相机方案&双相机方案

单分子成像经常与FRET技术联用，用于在单分子层面研究分子的构造变化（如蛋白质分子domain之间的距离变化等等）。由于FRET技术需要同时对两个波长同时监测采像，所以一般会在相机和显微镜之间加装双色分光器，通过二向色镜/滤光片按照波长将信号分开，并分别成像。滨松提供单相机双色同步成像和双相机双色同步成像等两套方案，前者成本较低，后者则有更大的视野范围以及更多扩展功能（如物镜后焦面成像、PSF修饰等）。

单相机双色同步成像方案