Flash4.0系列sCMOS相机高速成像性能在生物领域中的应用

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在生物成像中，对组织、细胞进行形态学观察或是在亚细胞层面上对特定分子进行定位常常是我们所要达到的目的。然而生物体的生长发育与生命活动以及细胞内部复杂的生化反应和信号传递等快速发生和变化的过程，往往是静态图像或者低速相机所无法捕捉的。这就需要具有高速成像能力的sCMOS相机来实现。

滨松的Flash4.0系列相机作为业界高灵敏度高速相机的代表，在一些高速成像的情况下有着卓越的表现力。下面我们通过一些例子来看看应用Flash4.0相机能从哪些方面提高生物成像的用户体验。

一、帮助使用者快速寻找样品和调节焦距

应用条件：无延迟的实时显示需要30fps以上的相机。产品型号推荐： Flash4.0 LT+/Flash4.0 LT

高速成像所带来的第一个好处就是寻找样品更加方便。在相机的成像速度还很缓慢的"旧CCD时代"，为了快速调节焦平面位置和寻找合适拍摄的样品，实验人员必须直接在目镜下进行观察。对于明场成像来说这并不困难，但是一些荧光信号可能弱到在目镜下无法直接观察，这就给实验人员带来了操作上的不便。Flash4.0的高灵敏度使得在弱荧光下相机仍然能在低曝光时间下对样品进行成像，实验人员可以在显示屏上直接观察镜下样品，调节载物台位置和焦距时图像无"延迟"，在合理的情况下大幅度降低激发的荧光功率，使光毒性降到最低。

Flash4.0的这种特性使其在一些特殊应用中发挥着独特的作用。例如膜片钳这种需要尽可能避免机械震动的应用，高速相机使得在显示屏上实时用玻璃电极对神经元进行显微操作成为可能（以避免肉眼在目镜下观察所带来的震动）。

二、捕捉高速运动的生物样品

一些生物样品在观察的过程中会发生快速的位移变化，有时需要对这些快速位移的样品进行细节上的记录，这时相机能够达到的帧速越快，对这些位移细节的刻画就越清晰。

小鼠心肌细胞搏动高速成像 100帧/秒原速

应用条件：明场高速成像只需要高速的sCMOS相机，心脏相关的成像速度一般在100fps以上。产品型号推荐：Flash4.0 LT+/Flash4.0 LT

斑马鱼血管高速荧光成 400帧/秒放慢20倍

应用条件：荧光高速成像需要高灵敏和高速同时具备的sCMOS相机，快速流动的荧光标记物的观察需要200fps以上，且相机QE需80%以上。产品型号推荐：Flash4.0 V3

三、捕捉荧光信号的快速变化

很多生理生化过程伴随着荧光信号的快速变化。对于这些快速变化的信号，有时单凭肉眼都无法辨别，此时通过Flash4.0的高速成像却能够很好的捕捉到这些信息。

神经元膜电位的超高速荧光成像

应用条件：膜电位高速成像作为一种特殊应用，只能用sCMOS相机快速流动的荧光标记物的观察需要200fps以上，且相机QE需80%以上产品型号推荐：Flash4.0 V3

在上图中，肉眼是看不到神经元胞体因膜电位变化而产生的荧光信号变化的；但是在高速成像下经过对图片灰度的时间分析，就能看到1ms时间尺度内荧光的快速变化了。

另外一些肉眼可以观察到的变化，通过高速成像则能够更好的研究其信号随时间的变化过程。例如钙离子荧光染料或荧光蛋白（Fluo-4、GCaMP等），其荧光强度会随钙离子浓度的升高而升高。同时图像的灰度可以提取出来进行半定量甚至是定量的计算。

心肌细胞钙离子浓度随时间的变化 200帧/秒放慢10倍

应用条件：荧光高速成像需要高灵敏和高速同时具备的sCMOS相机钙波与钙火花的观察需要200fps以上，且相机QE需80%以上。产品型号推荐： Flash4.0 V3/ Flash4.0 LT+

四、信号转导与下游效应记录

Flash4.0的高速还能够在毫秒级别以下记录到生物信号的转导与细胞产生的下游效应。例如在下面的例子中，对细胞钙离子信号和细胞收缩舒张的明场相差进行同步成像后，定量分析图像的灰度变化可以得到两个事件的时间信息。比较两个时间曲线我们能够看到，钙离子信号先发生变化，之后细胞才发生收缩形变，两者之间的时间差即为钙离子信号转导时间。

应用条件：荧光高速成像配合明场进行同步成像需要高灵敏和高速同时具备的sCMOS相机并搭配双色分光器组件相机需要200fps以上，相机QE需80%以上。产品型号推荐：Flash4.0 V3/ Flash4.0 LT+ + W-View Gemini

五、配合高端成像方法的应用

迅速发展的显微成像技术正对光探测器的性能不断提出新的要求。在对厚样品的深度成像或是对亚细胞结构的超分辨成像中，Flash4.0相机都以其优越的性能在成像探测器领域占有一席之地。

1、Light-sheet光片照明因其可与激光共聚焦相媲美的Z轴分辨率和比激光共聚焦更快的成像速度在一些模式动物器官和胚胎的活体成像中的具有显著优势。Flash4.0相机的高帧速成像能力配合片状光的扫描能够实现迅速对厚样品进行Z-stack扫描成像，并重建其3D结构。这种方法特别适合拍摄组织器官高速变化的情况（如心脏跳动）。

2、Spinning Disk共聚焦作为一种很成熟的共聚焦成像手段，能够提供点扫描共聚焦无法比拟的高速成像能力。这一高速成像能力除了要归功于Nipkow转盘带来的多针孔外，还需要sCMOS的高速拍摄性能相配合，从而在video-rate下得到与点扫描共聚焦相当的高分辨图片。

3、超分辨成像技术近几年取得的极大突破使得人类打破可见光的衍射极限，将可见光波段的细胞亚显微结构分辨率提高到了与电镜相当的水平。在各类超分辨技术中，Flash4.0的高速和高分辨率芯片很适合用于一大类称为SMSN(Single-Molecular Switching Nanoscopy) 的超分辨成像中（包括我们熟知的STROM和PALM）。通过短时间内的随机单分子荧光开-关，最终在毫秒级的时间尺度下形成一幅超分辨图像。而正是Flash4.0的高速和高灵敏度，能使得实验者使用更高的频率来随机激发单分子荧光开关，从而缩短整个系统的成像时间。

附：Flash4.0相机的帧速与ROI大小的关系

上一个：电生理测量、钙离子成像与加药灌流系统的同步解决方案

下一个： 荧光与明场的同步成像

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