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激光扫描共聚焦显微镜/双光子显微镜中的探测器


激光扫描共聚焦显微技术是荧光显微成像的一种,用于激发样品的荧光信号并对其放大成像。


在激光扫描共聚焦显微镜中,样品焦平面上每一时刻只有一个点被激发光照射,纵然焦平面外也有激发光照射,但通过探测器前的针孔(pinhole),仅有焦平面上的荧光信号能被探测器接收——也就是说,每个时刻,只有焦平面上一个点的信号被探测。通过点扫描的方式,一个个点的信号就可以组合出最终的图像。


双光子显微镜(包括多光子显微镜)同样采用点扫描的方式得到图像。不同的是,其采用的激发光波长较长,只有当两个(或更多)激发光光子几乎同时轰击荧光探针的时候才可能激发出荧光信号。所以只有在光子密度特别大的焦点出才会激发出荧光——也就是说,双光子显微镜中,同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测,并且连焦平面外的荧光信号也不会有。


图1. 激光扫描共聚焦显微镜和双光子显微镜的原理示意



这两种荧光显微成像技术在光路和激发光源上并不相同,但对探测器的要求却是类似的——点探测器,但需要足够灵敏。


# 选型



无论是激光扫描共聚焦显微镜还是双光子显微镜,其选用的主流探测器为光电倍增管(PMT,photomultiplier);此外,也有少数研究者/制造商采用HPD(hybride photodetector,推荐型号:R11322U-40,【1,2】)和雪崩二极管(APD,avalanche photodiode)。若需光谱探测,商业化仪器也有采用多阳极PMT(推荐型号:H11460-20,以多碱为光阴极材料的32通道PMT模块【3】)的实际案例。


在对PMT进行选型时,首先需要关注的是光阴极材料,因为其决定了PMT的光谱探测范围和大致的灵敏度。一般说来,共聚焦显微镜所用PMT中最常见的两种光阴极为GaAsP(镓砷磷)和Multialkali(多碱,MA),GaAsP的灵敏度较高而多碱的光谱探测范围更大(详细信息参考 FAQ1 )。



H7422-40 H10720-20 R10699
产品分类 PMT PMT PMT
产品集成度 模块 模块 裸管
光阴极材料 GaAsP Multialkali(MA) Multialkali(MA)
描述 共聚焦中最常用的GaAsP PMT模块型号。【4】 多碱PMT模块产品,方便使用。【5】 最新一代的多碱(Multialkali)PMT,其前代型号R928和R3896已被大量用于共聚焦应用之中。【6,7,8】



一般而言,如果不考虑大批量生产,我们建议采用PMT模块产品,方便使用(详细讨论参考 FAQ2 )。


以GaAsP为光阴极的PMT已经是目前共聚焦应用中的主流探测器,在标准型号H7422-40的基础上,滨松还针对来自用户的特别需求提供各种衍生型号(如图2):包括:(1)不带制冷的产品系列(如H10770系列,【9,10】,制冷的相关讨论参考 FAQ3 ;(2)为光子计数法所开发的产品系列(如H7421系列,【11】,光子计数的相关讨论参考 FAQ4 ;(3)放宽自我保护功能的产品系列(如H7422A系列,【9,10】,自我保护功能的相关讨论参考 FAQ5)。




图2. GaAsP PMT系列简介



有关共聚焦显微成像探测器的选型与使用中更详细的信息,请参考下面的FAQ如果有更多的问题,欢迎咨询网页顶端的联系人。


# FAQ


【选型】 有关光阴极的讨论
【选型】 有关裸管 & 模块的讨论
【选型】 制冷对于PMT的影响
【选型】 关于模拟法与光子计数法
【选型】 关于PMT的自我保护功能
【使用】 关于PMT灵敏度的离散性问题
【使用】 为了防止损坏,PMT使用中有什么注意事项
【使用】 如何设置PMT的工作电压来得到最理想的信噪比
【使用】 测试中发现背景高/信噪比不好,有可能有哪些原因
【使用】 PMT使用时是否需要预热
【使用】 PMT的寿命如何


FAQ1:有关光阴极的讨论


激光共聚焦显微镜中用的PMT主要有两类,一类的光阴极面采用多碱材料,一类采用GaAsP材料。


大体而言,多碱材料的光谱范围更宽,在700-800nm处都有不错的灵敏度。而GaAsP材料在生物成像特别关注的450-650nm处灵敏度要超出多碱材料。对于同样的一套共聚焦显微镜,如果探测是类似GFP这样的荧光探针,采用GaAsP PMT的成像效果要大大优于多碱PMT,以至于有评价说"用了GaAsP简直就是另一台仪器的感觉"。


但随着生物成像对穿透深度的要求,越来越多红光到近红外区域的荧光染料(如Cy7)会被使用。在这种情况下,多碱PMT还是有相应优势的。此外,对于近红外区的成像,还可以采用光阴极面为GaAs材料的PMT(如H7422-50,【12】),其近红外的灵敏度会更高。



图3. 共聚焦显微镜中常用的PMT型号光阴极面灵敏度对比



更多关于PMT光阴极面的讨论请参考: 《光电倍增管的光阴极技术》


FAQ2. 有关裸管和模块的讨论


图4展示了PMT裸管和模块之间的关系。PMT输出的都是电流信号。在当前的共聚焦显微镜中,一般是将PMT输出的信号转化为电压(通过跨阻放大器),然后通过数据采集卡转化为数字信号到电脑软件。


由于PMT需要提供几百到一千伏左右的高电压。所以用PMT裸管时,需要另外配置高压电源与分压电路;而为了方便使用,电流输出PMT模块则将PMT裸管、分压电路与高压电源打包在了一起。以H7422-40(电流输出PMT模块)为例,使用中用户不再需要考虑高压的问题,仅需提供11.5-15.5V的供电电压;并且可以通过0.5-0.8V的输入电压来调节PMT的实际工作电压(几百到一千伏左右)。




图4. PMT模块的构成示意


# 电流型PMT模块的推荐配置方案——以H7422-40系列为例



图5. H7422-40电流型PMT模块的配置示例


# PMT裸管的推荐配置方案——以R10699为例



图6. R10699 PMT的配置示例


FAQ3. 制冷对于PMT的影响


制冷主要能够减小光阴极和各打拿级的热电子发射,降低暗噪声。下表对比了有制冷的H7422系列以及没有制冷的H10770系列的主要参数,从中可以看出其区别。


H7422PA-40 H10770PA-40
制冷
阴极辐射灵敏度 199 mA/W [typ.] 199 mA/W [typ.]
阳极辐射灵敏度 398,000 A/W [typ.] 398,000 A/W [typ.]
暗噪声
(阳极,30min稳定)
0.4 nA [typ.]
1.0 nA [max]
3.3 nA [typ.]
9.3 nA [max]
暗计数
(阳极)
100 s-1 [typ.]
300 s-1 [max]
6,000 s-1 [typ.]
18,000 s-1 [max]


关于暗噪声的详细讨论,可参考 FAQ8


FAQ4.关于模拟法与光子计数法


FAQ2所述。PMT大体上可以分为模拟工作模式和光子计数工作模式。当光信号极弱的时候(如图7的B区域),只有偶尔的几个光子能够落到PMT的感光面上;其中每个光子转化为电子之后,经过倍增成为许多电子打到PMT的阳极上,经过读出,在示波器上显示为一个峰;而PMT的暗噪声也会表现为一个个的峰,但由于暗噪声的来源可能是打拿级的热电子发射,经历的倍增较小,所以部分暗噪声的峰会较矮。


对于模拟工作模式,无论是信号峰还是来自暗噪声的峰都会被无差别地收集(如图8-A);但在光子计数工作模式中,足够高的峰才会被计数,而较矮的峰——主要来自于暗噪声——则会被忽略(如图8-B)。


所以在光极弱的时候,光子计数法的信噪比要更高一些。(如图8)




图7. PMT实际探测案例。光源为闪烁的LED灯。A与C区域为灯亮,B区域为灯灭。B区域的信号来自于系统的漏光和暗电流。




图8. 模拟法(A)和光子计数法(B)的信噪比示意。红色代表来自真实光子信号的峰;绿色代表来自暗噪声的峰。由于真实光子所转化出的电子在PMT内都经历了完整的倍增过程,所以峰较高;而暗噪声有可能来源于某一个打拿级的热电子发射,不一定精力的完整的倍增过程,所以一部分暗噪声的峰会较矮。


但是,随着光强逐渐增加,峰的密度会上升,最终重叠到一起(如图7的A区域和C区域)。显然,当峰无法区分的时候,光子计数法就有可能将2个或者更多的峰识别为1个峰,使得光子计数模式所得出的结果与真实信号不再呈线性关系。这对于共聚焦应用是不能接受的。


一般而言,滨松光子计数探头的线性上限为1-20MHz;以H7421-40这款光阴极面为GaAsP的光子计数探头为例,其线性上限(Count linearity)为1.5MHz,即每秒钟从光子转换的电子有150万个或更少的时候,其给出的计数结果与光强成正比;而如果信号超过这个标准,计数结果就和光强不再成正比了。


那1.5MHz在共聚焦成像中是什么概念呢?假设我们希望在1s内拿到一张512x512的图像(也就是说停留时间/dwell time大致为4us)。那么平均分到每个像素就是1.5MHz*4us=6。这意味着只要每个像素上的信号多于6个峰,那么光子计数法就不再合适(超出线性)了。而每个像素上最多6个峰这样的限制(动态范围太小)显然是不能满足生物显微成像需求的。所以要么是增加dwell time(如【11】,采用了102us的dwell time),要么就重复扫描并叠加多张图片。


FAQ5. 关于PMT的自我保护功能


有的PMT模块产品(主要是H7422系列的产品)为了防止强光对PMT噪声损伤,有内部保护电路,当入射信号光过强的时候,会直接使PMT的工作电压变为0. 只有当再次点击测量的时候,PMT才可以正常工作。这在实际的显微过程中会导致一些问题,比如有的时候样品上会被激光打出来坏点,这个坏点的信号可能会显著增强,当扫描到这个点的时候,PMT触发了自我保护功能,从而导致后面的点没有数据。


为了解决这个问题可以考虑:(1)在H7422等系列中选择带A的型号,如H7422-40的过曝保护阈值为10uA,而H7422A-40的过曝保护阈值则高至50uA ;(2)在出厂的时候主动要求滨松更改触发自我保护的电流阈值,从而使PMT不那么容易触发自我保护。


FAQ6. 关于PMT灵敏度的离散性问题


PMT都是手工制作的,所以PMT的增益会有一定的离散性。即使是同一型号同一批次,各支PMT之间的灵敏度也会有所区别。


选型中,滨松可以根据客户要求,出厂前对PMT进行灵敏度挑选。


使用中,对于同一个探测器,输出的结果能够反映被探测光的强度和变化,一般情况下这种变化是线性的。用户可以根据需要,考虑用标准样品对每支PMT进行一致性标定,这样在线性范围内只需要一个系数校正即可保证不同PMT的数据可互相比较。


FAQ7. 为了防止损坏,PMT使用中有什么注意事项


1. 曝光损坏问题

PMT受到强光照射以后,会发生光敏效应,造成PMT一段时间内的暗电流上升。在一定范围内,这种暗计数上升是可恢复的,需要不加电在暗环境下静置一段时间;为加快这种恢复,也可以加电在暗环境下静置。


需要注意的是,当PMT所受的光足够强,会造成PMT不可逆的损坏;虽然PMT各型号的参数不一,但一般而言:


(1) 对于已经通电的PMT,如果被满月的月光直射,就能使其输出饱和——所以说,强于满月月光直射的环境光对于已经通电的PMT是需要避免的。


(2) 即使对于没有通电的PMT,如果被夏天中午的太阳直射,也会造成永久损伤——所以说,只要环境光显著地弱于夏天中午的太阳直射(如日常的室内环境),是不会对没有通电的PMT造成永久损伤的。


事实上,带电见强光是造成PMT损坏的主要原因(称为曝光损坏)。为了避免曝光损坏,我们推荐:(1)在不进行扫描成像的时候,不给PMT加高压;(2)在进行成像的时候要保证显微镜本身处于暗室环境下,不要在测量时开灯,更换滤光片等;(3)对于样本信号强度不确定的情况,为了防止PMT输出饱和,推荐先使用较低的激发功率或者降低PMT的增益(如降低供给PMT的电压)。


2. 高压问题

PMT需要在高压的情况下工作,一般需要做一些类似屏蔽的安全措施。对于型号以"H"开头的模块产品(如H7422P-40),其内部有1000V左右的高压,滨松公司已经做了良好的屏蔽,所以在正常使用情况下,不会有高压电击的问题,不建议对模块产品进行拆解,如果一定需要拆解使用,请谨防高压损伤。


3. 光窗挤压问题

无论是PMT裸管(以"R"开头的PMT型号,如R10699)还是PMT模块产品(以"H"开头的型号,如H7422-40),其光窗都属于玻璃易碎产品,不允许大力挤压,有些PMT模块产品的的光窗和外壳基本上在一个平面上,安装过程中尤其要注意避免对光窗的挤压。


FAQ8. 如何设置PMT的工作电压来得到最理想的信噪比?


在共聚焦显微镜中,PMT主要工作在模拟模式下,相关的信噪比公式可表述为:




PMT的信号输出与增益成正比,随工作电压呈指数上升(如图9左上的虚线)。


PMT的暗电流(即"与增益呈正相关的噪声")随着工作电压的变化则分成三段:(1)在a区域,PMT的暗电流主要是来自于漏电电流,随电压的增速慢于信号;(2)在b区域,PMT暗电流主要是来自于光阴极面和打拿级面的热电子发射,随电压的增速与信号类似;(3)而在c区域,PMT的暗电流主要是来自于场致发射,随电压的增速快于信号。


综合上述情况,在 b区时PMT的信噪比是最高的;但考虑整个探测系统时,后续处理电路(放大器,数据采集卡)还会引入一些额外的噪声(即"不会被增益放大的噪声" )。电压越高(即增益越大),PMT输出的信号相对这些额外的噪声就越大,有利于提升整个系统的信噪比。所以在实际使用中,我们推荐一直调高电压直到下述两种情况之一发生,然后略微降低一点电压得到最理想的效果:


(1)图像饱和。


(2)图像突然出现大量噪声。这是PMT从b区进入c区的现象。



图9. PMT暗电流与工作电压的关系。


FAQ9. 测试中发现背景高/信噪比不好,有可能有哪些原因?


1. 漏光影响

大部分在应用中遇到的噪声高、本底高的问题,都是由于漏光引起的,PMT是非常灵敏的探测器,对于单光子信号就有非常好的响应。因而比如手机的灯光,电脑显示器的灯光都有可能造成暗电流增加的问题。此外在共聚焦荧光显微镜中,也需要考虑PMT前的滤光片的选择是否合理,是否能够有效的排除激发光以及其它波长荧光的影响。推荐在选择在非探测波长OD>5的滤光片。


2. 工作电压

如FAQ8可知,当PMT的增益过大的时候,会引起场致发射现象,导致PMT的噪声显著的提高,此时会严重降低信噪比。因而当信号很微弱的时候,不宜无限制的提高PMT的增益,而可以考虑通过延长曝光时间,增加激发光功率,增加后面放大器的放大倍数等方式来增强输出的信号。


3. PMT损坏的问题

由于不恰当的使用,有可能会PMT的损坏,导致暗噪声增高,或者响应发生问题。对于暗噪声,可以使用多层黑布对PMT进行包裹,然后上电稳定以后,使用示波器对PMT输出进行暗计数的评价,如果暗计数大概是在几千量级,暗噪声应该是没有问题的。对于响应问题,发生概率一般较低,最方便的方法就是准备些标准样品,知道在某工作条件下,信号应该是多少,这样通过对比标准样品的信号强度,就可以大体知道PMT是否有问题。此外,也可以将PMT遮光,使用示波器测量PMT输出单光子脉冲高度(电压值),当负载为50欧姆时,理论上:

一般如果能到理论的单光子高度附近,就说明增益没有问题。


4. 电磁屏蔽

由于荧光显微镜系统一般包含许多电子仪器、元件等,它们会产生较强的电磁干扰。因而如果电磁屏蔽做的不够好,也可能会导致信噪比不好的问题。推荐在PMT与数据采集卡之间使用屏蔽性能好的信号线,同时尽量避免使用转接头。



FAQ10. PMT使用时是否需要预热?


为了保证PMT输出信号的稳定性,在使用前通常需要对PMT进行预热。一般就是把PMT的电压设置为正常使用时的电压,然后让PMT在暗室运行大概1小时就可以了。不过如果测量的图像没有定量的需求,也不需要如此久的曝光时间,基本上开机直接使用就可以。


FAQ11. PMT的寿命如何?


在PMT工作时,电子会不断轰击打拿级,造成打拿级的损坏。PMT输出的总电荷数越多,说明打拿级,尤其是最后一级打拿级被轰击得越厉害,损坏得也就越严重。


实际上,打拿级的损坏会使得同样的信号和条件下,在阳极输出的电流会发生抖动(drift),随着不断使用,这种抖动会越来越剧烈。同时,输出的信号也会在一定阶段之后越来越弱(如图10)。


综上所述,PMT的寿命只与输出的总电荷数有关。


图10展示了滨松的PMT在阳极输出电流为100微安,工作电压为1000V的阳极灵敏度随着时间变化的曲线。可以看到PMT寿命在初始输出为100微安的大电流时即使工作1万小时,其输出强度下降也不到一半。


不过如果工作电压过高或者带电被强光照射,PMT的寿命会显著降低。 在不通电的情况下,如果被强光直射,也会显著降低PMT的寿命,因此不管在何时都应注意PMT的避光。


图10. PMT随使用而产生的灵敏度变动示意


# 相关论文


编号

文献

关键词

滨松产品

备注

1

PLoS ONE (2017)12: e0179460


双光子

R11322U-40

2

Biomedical Optics Express (2017)8:3213

双光子

R11322U-40

3

Journal of Fluorescence (2005)15:41

双光子,光谱,光子计数

R5900U
H7260

推荐的H11460是H7260所对应的模块产品

4

Physics Review Letters (2007) 99:228105

单光子

H7422-40

5

Computational and Mathematical Methods in Medicine (2013):890203

单光子

H10720

6

J. Biomedical Optics (2001) 6:300

双光子

R928

7

Cell Calcium (1999) 26:271

单光子

R928

8

Journal of Microscopy (2007) 227:203

单光子,光谱

R3896

9

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2013) 110:6724

双光子

H10770PA-40

10

PLOS one (2014) 9:e110475

双光子

H10770PA-40

11

Optics Letters (2008) 33:2895

双光子,光子计数

H7421-40

12

Investigative Ophthalmology & Visual Science (2016)57:647

双光子

H7422-50
H7422-40

13

Neuron (2006) 50:823

双光子

H7422P


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