激光扫描共聚焦显微镜/双光子显微镜中的探测器
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激光扫描共聚焦显微技术是荧光显微成像的一种，用于激发样品的荧光信号并对其放大成像。
在激光扫描共聚焦显微镜中，样品焦平面上每一时刻只有一个点被激发光照射，纵然焦平面外也有激发光照射，但通过探测器前的针孔（pinhole），仅有焦平面上的荧光信号能被探测器接收——也就是说，每个时刻，只有焦平面上一个点的信号被探测。通过点扫描的方式，一个个点的信号就可以组合出最终的图像。
双光子显微镜（包括多光子显微镜）同样采用点扫描的方式得到图像。不同的是，其采用的激发光波长较长，只有当两个（或更多）激发光光子几乎同时轰击荧光探针的时候才可能激发出荧光信号。所以只有在光子密度特别大的焦点出才会激发出荧光——也就是说，双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。
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图1. 激光扫描共聚焦显微镜和双光子显微镜的原理示意
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这两种荧光显微成像技术在光路和激发光源上并不相同，但对探测器的要求却是类似的——点探测器，但需要足够灵敏。
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无论是激光扫描共聚焦显微镜还是双光子显微镜，其选用的主流探测器为光电倍增管（PMT，photomultiplier）；此外，也有少数研究者/制造商采用HPD（hybride photodetector，推荐型号：R11322U-40，【1，2】）和雪崩二极管（APD，avalanche photodiode）。若需光谱探测，商业化仪器也有采用多阳极PMT（推荐型号：H11460-20，以多碱为光阴极材料的32通道PMT模块【3】）的实际案例。
在对PMT进行选型时，首先需要关注的是光阴极材料，因为其决定了PMT的光谱探测范围和大致的灵敏度。一般说来，共聚焦显微镜所用PMT中最常见的两种光阴极为GaAsP（镓砷磷）和Multialkali（多碱，MA），GaAsP的灵敏度较高而多碱的光谱探测范围更大（详细信息参考 FAQ1 ）。
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H7422-40
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H10720-20
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R10699
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产品分类
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PMT
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PMT
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PMT
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产品集成度
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模块
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模块
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裸管
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光阴极材料
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GaAsP
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Multialkali（MA）
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Multialkali（MA）
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描述
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共聚焦中最常用的GaAsP PMT模块型号。【4】
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多碱PMT模块产品，方便使用。【5】
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最新一代的多碱（Multialkali）PMT，其前代型号R928和R3896已被大量用于共聚焦应用之中。【6，7，8】
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一般而言，如果不考虑大批量生产，我们建议采用PMT模块产品，方便使用（详细讨论参考 FAQ2 ）。
以GaAsP为光阴极的PMT已经是目前共聚焦应用中的主流探测器，在标准型号H7422-40的基础上，滨松还针对来自用户的特别需求提供各种衍生型号（如图2）：包括：（1）不带制冷的产品系列（如H10770系列，【9，10】，制冷的相关讨论参考 FAQ3） ；（2）为光子计数法所开发的产品系列（如H7421系列，【11】，光子计数的相关讨论参考 FAQ4） ；（3）放宽自我保护功能的产品系列（如H7422A系列，【9，10】，自我保护功能的相关讨论参考 FAQ5）。
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有关共聚焦显微成像探测器的选型与使用中更详细的信息，请参考下面的FAQ如果有更多的问题，欢迎咨询网页顶端的联系人。
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激光共聚焦显微镜中用的PMT主要有两类，一类的光阴极面采用多碱材料，一类采用GaAsP材料。
大体而言，多碱材料的光谱范围更宽，在700-800nm处都有不错的灵敏度。而GaAsP材料在生物成像特别关注的450-650nm处灵敏度要超出多碱材料。对于同样的一套共聚焦显微镜，如果探测是类似GFP这样的荧光探针，采用GaAsP PMT的成像效果要大大优于多碱PMT，以至于有评价说"用了GaAsP简直就是另一台仪器的感觉"。
但随着生物成像对穿透深度的要求，越来越多红光到近红外区域的荧光染料（如Cy7）会被使用。在这种情况下，多碱PMT还是有相应优势的。此外，对于近红外区的成像，还可以采用光阴极面为GaAs材料的PMT（如H7422-50，【12】），其近红外的灵敏度会更高。
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图3. 共聚焦显微镜中常用的PMT型号光阴极面灵敏度对比
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图4展示了PMT裸管和模块之间的关系。PMT输出的都是电流信号。在当前的共聚焦显微镜中，一般是将PMT输出的信号转化为电压（通过跨阻放大器），然后通过数据采集卡转化为数字信号到电脑软件。
由于PMT需要提供几百到一千伏左右的高电压。所以用PMT裸管时，需要另外配置高压电源与分压电路；而为了方便使用，电流输出PMT模块则将PMT裸管、分压电路与高压电源打包在了一起。以H7422-40（电流输出PMT模块）为例，使用中用户不再需要考虑高压的问题，仅需提供11.5-15.5V的供电电压；并且可以通过0.5-0.8V的输入电压来调节PMT的实际工作电压（几百到一千伏左右）。
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# 电流型PMT模块的推荐配置方案——以H7422-40系列为例
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图5. H7422-40电流型PMT模块的配置示例
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# PMT裸管的推荐配置方案——以R10699为例
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制冷主要能够减小光阴极和各打拿级的热电子发射，降低暗噪声。下表对比了有制冷的H7422系列以及没有制冷的H10770系列的主要参数，从中可以看出其区别。
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H7422PA-40
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H10770PA-40
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制冷
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有
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无
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阴极辐射灵敏度
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199 mA/W [typ.]
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199 mA/W [typ.]
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阳极辐射灵敏度
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398,000 A/W [typ.]
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398,000 A/W [typ.]
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暗噪声
（阳极，30min稳定）
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0.4 nA [typ.]
1.0 nA [max]
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3.3 nA [typ.]
9.3 nA [max]
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暗计数
（阳极）
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100 s-1 [typ.]
300 s-1 [max]
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6,000 s-1 [typ.]
18,000 s-1 [max]
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如 FAQ2所述。PMT大体上可以分为模拟工作模式和光子计数工作模式。当光信号极弱的时候（如图7的B区域），只有偶尔的几个光子能够落到PMT的感光面上；其中每个光子转化为电子之后，经过倍增成为许多电子打到PMT的阳极上，经过读出，在示波器上显示为一个峰；而PMT的暗噪声也会表现为一个个的峰，但由于暗噪声的来源可能是打拿级的热电子发射，经历的倍增较小，所以部分暗噪声的峰会较矮。
对于模拟工作模式，无论是信号峰还是来自暗噪声的峰都会被无差别地收集（如图8-A）；但在光子计数工作模式中，足够高的峰才会被计数，而较矮的峰——主要来自于暗噪声——则会被忽略（如图8-B）。
所以在光极弱的时候，光子计数法的信噪比要更高一些。（如图8）
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图7. PMT实际探测案例。光源为闪烁的LED灯。A与C区域为灯亮，B区域为灯灭。B区域的信号来自于系统的漏光和暗电流。
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图8. 模拟法（A）和光子计数法（B）的信噪比示意。红色代表来自真实光子信号的峰；绿色代表来自暗噪声的峰。由于真实光子所转化出的电子在PMT内都经历了完整的倍增过程，所以峰较高；而暗噪声有可能来源于某一个打拿级的热电子发射，不一定精力的完整的倍增过程，所以一部分暗噪声的峰会较矮。
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但是，随着光强逐渐增加，峰的密度会上升，最终重叠到一起（如图7的A区域和C区域）。显然，当峰无法区分的时候，光子计数法就有可能将2个或者更多的峰识别为1个峰，使得光子计数模式所得出的结果与真实信号不再呈线性关系。这对于共聚焦应用是不能接受的。
一般而言，滨松光子计数探头的线性上限为1-20MHz；以H7421-40这款光阴极面为GaAsP的光子计数探头为例，其线性上限（Count linearity）为1.5MHz，即每秒钟从光子转换的电子有150万个或更少的时候，其给出的计数结果与光强成正比；而如果信号超过这个标准，计数结果就和光强不再成正比了。
那1.5MHz在共聚焦成像中是什么概念呢？假设我们希望在1s内拿到一张512x512的图像（也就是说停留时间/dwell time大致为4us）。那么平均分到每个像素就是1.5MHz*4us=6。这意味着只要每个像素上的信号多于6个峰，那么光子计数法就不再合适（超出线性）了。而每个像素上最多6个峰这样的限制（动态范围太小）显然是不能满足生物显微成像需求的。所以要么是增加dwell time（如【11】，采用了102us的dwell time），要么就重复扫描并叠加多张图片。
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有的PMT模块产品（主要是H7422系列的产品）为了防止强光对PMT噪声损伤，有内部保护电路，当入射信号光过强的时候，会直接使PMT的工作电压变为0. 只有当再次点击测量的时候，PMT才可以正常工作。这在实际的显微过程中会导致一些问题，比如有的时候样品上会被激光打出来坏点，这个坏点的信号可能会显著增强，当扫描到这个点的时候，PMT触发了自我保护功能，从而导致后面的点没有数据。
为了解决这个问题可以考虑：（1）在H7422等系列中选择带A的型号，如H7422-40的过曝保护阈值为10uA，而H7422A-40的过曝保护阈值则高至50uA ；（2）在出厂的时候主动要求滨松更改触发自我保护的电流阈值，从而使PMT不那么容易触发自我保护。
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PMT都是手工制作的，所以PMT的增益会有一定的离散性。即使是同一型号同一批次，各支PMT之间的灵敏度也会有所区别。
选型中，滨松可以根据客户要求，出厂前对PMT进行灵敏度挑选。
使用中，对于同一个探测器，输出的结果能够反映被探测光的强度和变化，一般情况下这种变化是线性的。用户可以根据需要，考虑用标准样品对每支PMT进行一致性标定，这样在线性范围内只需要一个系数校正即可保证不同PMT的数据可互相比较。
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1. 曝光损坏问题
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PMT受到强光照射以后，会发生光敏效应，造成PMT一段时间内的暗电流上升。在一定范围内，这种暗计数上升是可恢复的，需要不加电在暗环境下静置一段时间；为加快这种恢复，也可以加电在暗环境下静置。
需要注意的是，当PMT所受的光足够强，会造成PMT不可逆的损坏；虽然PMT各型号的参数不一，但一般而言：
（1） 对于已经通电的PMT，如果被满月的月光直射，就能使其输出饱和——所以说，强于满月月光直射的环境光对于已经通电的PMT是需要避免的。
（2） 即使对于没有通电的PMT，如果被夏天中午的太阳直射，也会造成永久损伤——所以说，只要环境光显著地弱于夏天中午的太阳直射（如日常的室内环境），是不会对没有通电的PMT造成永久损伤的。
事实上，带电见强光是造成PMT损坏的主要原因（称为曝光损坏）。为了避免曝光损坏，我们推荐：（1）在不进行扫描成像的时候，不给PMT加高压；（2）在进行成像的时候要保证显微镜本身处于暗室环境下，不要在测量时开灯，更换滤光片等；（3）对于样本信号强度不确定的情况，为了防止PMT输出饱和，推荐先使用较低的激发功率或者降低PMT的增益（如降低供给PMT的电压）。
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2. 高压问题
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PMT需要在高压的情况下工作，一般需要做一些类似屏蔽的安全措施。对于型号以"H"开头的模块产品（如H7422P-40），其内部有1000V左右的高压，滨松公司已经做了良好的屏蔽，所以在正常使用情况下，不会有高压电击的问题，不建议对模块产品进行拆解，如果一定需要拆解使用，请谨防高压损伤。
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3. 光窗挤压问题
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无论是PMT裸管（以"R"开头的PMT型号，如R10699）还是PMT模块产品（以"H"开头的型号，如H7422-40），其光窗都属于玻璃易碎产品，不允许大力挤压，有些PMT模块产品的的光窗和外壳基本上在一个平面上，安装过程中尤其要注意避免对光窗的挤压。
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在共聚焦显微镜中，PMT主要工作在模拟模式下，相关的信噪比公式可表述为：
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PMT的信号输出与增益成正比，随工作电压呈指数上升（如图9左上的虚线）。
PMT的暗电流（即"与增益呈正相关的噪声"）随着工作电压的变化则分成三段：（1）在a区域，PMT的暗电流主要是来自于漏电电流，随电压的增速慢于信号；（2）在b区域，PMT暗电流主要是来自于光阴极面和打拿级面的热电子发射，随电压的增速与信号类似；（3）而在c区域，PMT的暗电流主要是来自于场致发射，随电压的增速快于信号。
综合上述情况，在 b区时PMT的信噪比是最高的；但考虑整个探测系统时，后续处理电路（放大器，数据采集卡）还会引入一些额外的噪声（即"不会被增益放大的噪声" ）。电压越高（即增益越大），PMT输出的信号相对这些额外的噪声就越大，有利于提升整个系统的信噪比。所以在实际使用中，我们推荐一直调高电压直到下述两种情况之一发生，然后略微降低一点电压得到最理想的效果：
（1）图像饱和。
（2）图像突然出现大量噪声。这是PMT从b区进入c区的现象。
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1. 漏光影响
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大部分在应用中遇到的噪声高、本底高的问题，都是由于漏光引起的，PMT是非常灵敏的探测器，对于单光子信号就有非常好的响应。因而比如手机的灯光，电脑显示器的灯光都有可能造成暗电流增加的问题。此外在共聚焦荧光显微镜中，也需要考虑PMT前的滤光片的选择是否合理，是否能够有效的排除激发光以及其它波长荧光的影响。推荐在选择在非探测波长OD>5的滤光片。
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2. 工作电压
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如FAQ8可知，当PMT的增益过大的时候，会引起场致发射现象，导致PMT的噪声显著的提高，此时会严重降低信噪比。因而当信号很微弱的时候，不宜无限制的提高PMT的增益，而可以考虑通过延长曝光时间，增加激发光功率，增加后面放大器的放大倍数等方式来增强输出的信号。
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3. PMT损坏的问题
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由于不恰当的使用，有可能会PMT的损坏，导致暗噪声增高，或者响应发生问题。对于暗噪声，可以使用多层黑布对PMT进行包裹，然后上电稳定以后，使用示波器对PMT输出进行暗计数的评价，如果暗计数大概是在几千量级，暗噪声应该是没有问题的。对于响应问题，发生概率一般较低，最方便的方法就是准备些标准样品，知道在某工作条件下，信号应该是多少，这样通过对比标准样品的信号强度，就可以大体知道PMT是否有问题。此外，也可以将PMT遮光，使用示波器测量PMT输出单光子脉冲高度（电压值），当负载为50欧姆时，理论上：
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一般如果能到理论的单光子高度附近，就说明增益没有问题。
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4. 电磁屏蔽
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由于荧光显微镜系统一般包含许多电子仪器、元件等，它们会产生较强的电磁干扰。因而如果电磁屏蔽做的不够好，也可能会导致信噪比不好的问题。推荐在PMT与数据采集卡之间使用屏蔽性能好的信号线，同时尽量避免使用转接头。
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为了保证PMT输出信号的稳定性，在使用前通常需要对PMT进行预热。一般就是把PMT的电压设置为正常使用时的电压，然后让PMT在暗室运行大概1小时就可以了。不过如果测量的图像没有定量的需求，也不需要如此久的曝光时间，基本上开机直接使用就可以。
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在PMT工作时，电子会不断轰击打拿级，造成打拿级的损坏。PMT输出的总电荷数越多，说明打拿级，尤其是最后一级打拿级被轰击得越厉害，损坏得也就越严重。
实际上，打拿级的损坏会使得同样的信号和条件下，在阳极输出的电流会发生抖动（drift），随着不断使用，这种抖动会越来越剧烈。同时，输出的信号也会在一定阶段之后越来越弱（如图10）。
综上所述，PMT的寿命只与输出的总电荷数有关。
图10展示了滨松的PMT在阳极输出电流为100微安，工作电压为1000V的阳极灵敏度随着时间变化的曲线。可以看到PMT寿命在初始输出为100微安的大电流时即使工作1万小时，其输出强度下降也不到一半。
不过如果工作电压过高或者带电被强光照射，PMT的寿命会显著降低。 在不通电的情况下，如果被强光直射，也会显著降低PMT的寿命，因此不管在何时都应注意PMT的避光。
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