应用实例：双色同步成像_滨松光子学商贸(中国)有限公司

应用实例：双色同步成像

郑一哲（zyz@hamamatsu.com.cn）

荧光的共定位是当今生物显微成像中一个极为常见的技术，两个或者更多种不同颜色的荧光探针被用来标记不同的结构/位点，使得其相互关系得以明晰地在合并的图像上展现。随着研究者对于实验的要求越来越高，这些荧光共定位的成像逐渐被希望能用于荧光强度高速变化或者样品本身位置不断变化的实验中，比如活动的斑马鱼、线虫体内两类神经细胞的荧光共定位成像。在这些实验中，由于样品本身是运动的，两个颜色的成像时间间隔越短，越能够反映荧光探针共定位的真实情况。

在另外一些实验中，同一个荧光探针的荧光颜色(波长)会随着环境的变化而发生变化，那么前后两种颜色荧光强度的比值就能反映出环境的变化，如Di4之于细胞膜电位，Cameleon之于Ca离子浓度等等。当相关的环境变化速度比较快的时候，两个颜色的成像时间间隔越短，测量也就越精确。

综合以上两类成像实验，均是需要尽可能地将两个不同颜色荧光信号在同一时刻拍摄下来，那么最理想的情况就是我们在这篇Application notes中所提到的双色同步成像，即完全同时地拍摄两个颜色通道的荧光信号。

双色同步成像——采用W-View GEMINI的完全同步成像

双色同步成像最直接的思路就是用彩色相机，但如今绝大多数的彩色相机是在黑白芯片的基础上将每个像素前添加滤光涂层（一般为红、绿、蓝三种，如下图），此彩色滤光涂层使得不同的像素可以分别得到不同的颜色信息，最后合成出彩色的图片。这样的设计在明场成像（如HE染色，免疫组化切片）中不可或缺，但对于生物荧光信号的成像却是有缺陷的。首先，滤光涂层的出现会吸收或反射部分入射光信号，降低整个芯片的灵敏度，在信号本来就较弱的荧光拍摄中会影响到成像信噪比；其次，由于不同像素前存在不同颜色的滤光涂层，对于单色光信号——比如荧光信号——的实际分辨率将被降低。换句话说，对于一台140万像素的彩色CCD相机，其真正能够检测到绿色荧光信号的像素仅有约70万个像素，其余的70万像素的绿光强度信息均为计算获得（注：因为绿色为人眼最为敏感的颜色，所以一般彩色相机中以4个像素为一组，两个像素采用绿色涂层，其余两个像素则分别采用蓝色及红色涂层）。更重要的，如果采用这类彩色相机用于双色荧光同步成像，一些颜色并不是红绿蓝三种颜色（对应彩色相机像素上的三种滤光涂层）的荧光探针将受到极大的限制。

所以传统上，许多实验室通过切换显微镜上的滤光块转盘或者是采用滤光轮进行不同颜色之间的切换。但这样无法做到完全同步拍摄两个颜色的图片，滤光块转盘的切换时间需要约1秒钟，而滤光轮不同滤光片之间的每一次切换也需要几十毫秒时间，事实上影响了实验的时间分辨率，所以在比较高速的比例成像等场合，采用滤光轮或者滤光块转盘都容易造成数据的误差（举例计算请参考下面所示的"应用实例1"）。

而采用滨松W-View GEMINI则完全没有这样的担心，两个颜色的信号被成像到相机的上下两半感光芯片上，实现了两个颜色成像的完全同步。

双色同步成像——一台Flash 4.0 LT相机作两台用

采用W-View GEMINI这样的双色分光附件将两种颜色的信号成像到一台相机的一个感光芯片上很好地解决了同步成像的时间问题，但对于绝大多数的相机，整个感光芯片只能设置一个曝光时间，当两个颜色的信号强度相差较大时将很难同时将两个颜色的成像信噪比保证在最佳状态。

而滨松Flash 4.0 LT则可以分别调整同一芯片上下两半的曝光时间。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0 LT的时候，我们可以非常灵活地调整两个颜色信号的相对亮度，得到更加能够突出所需信号和结构的图片。在两个颜色通道的信号差别非常大的时候，Flash 4.0 LT + W-View GEMINI这种灵活的曝光时间设置就可以针对不同的波长设置不同的曝光时间，同时保证两个波长信号的信噪比。

W-View GEMINI应用实例1——表达Cameleon (YC3.60)的HeLa细胞在收到组胺刺激时的高速钙离子成像

在细胞内钙离子浓度高速变化的场合下，双色同步成像可以保证数据的高速采集。以这个实验为例，YC3.60的分子中包含CFP、YFP两个部分，没有钙离子结合时，两个部分距离较远，用430nm的光激发时得到的是CFP所发射的480nm的青色信号；当结合了钙离子之后，YC3.60中CFP和YFP两个部分在分子中会挨到一块儿，符合CFP-YPF发生FRET的条件，430nm激发光照射时，能量将由CFP转移至YFP，发射出535nm的黄色荧光信号。所以通过实时检测480nm和535nm的信号强度比值就可以监测细胞内钙离子的浓度。

如果采用滤光轮，假设不同滤光片位置的切换时间为30ms（这已经是比较出色的产品了），CFP和YFP各自需要30ms曝光时间，一个数据点需要切换两次滤光片位置（如从CFP切换到YFP然后还得切换回来预备下一个数据点的采像），所以总共需要120ms来采集一个数据点，结果就是当我们采用滤光轮的配置时每秒钟我们只能得到8-9个数据点（钙离子浓度数据）。

而采用W-View GEMINI时，30ms的曝光时间内就可以同时采集到CFP和YFP的荧光信号，而且没有颜色切换的时间损失，最终保证了33帧/秒的高速成像，也就是说，每秒钟我们可以得到33个钙离子浓度数据点。

两种方法在动力学上的表现高下立判。

W-View GEMINI应用实例2——采用Di-4-ANEPPS对hiPS-心肌细胞的膜电位变化进行成像

对于样品有位置移动的情况下，双色同步成像可以抵消样品位置变化所造成的误差。比如这个例子中的诱导心肌细胞，我们需要通过Di-4-ANEPPS这个染料对其膜动作电位进行成像。Di-4-ANEPPS这种荧光染料通过蓝光（~488nm）激发，其发射波长却会根据膜电位而有所变化，通过计算细胞不同区域内525nm/630nm的比值就可以得到此区域内膜电位的变化。这种成像方法相相对膜片钳等电生理方法而言，可以得到细胞任意位置的膜电位变化，空间分辨率更高。而W-View GEMINI双色分光附件以及高速高灵敏度的Flash 4.0 sCMOS相机的应用也保证了其极高的时间分辨率（每秒100个数据点），使得我们可以对细胞任意位置的动作电位进行时间空间都非常精确的测量。

W-View GEMINI应用实例3——线虫盐敏感（salt-sensing）神经元在NaCl浓度变化时响应的时空关系分析

在这个例子中，为了监测ASER和AIY两个神经元在外界NaCl浓度变化时的表现，研究者分别在两个神经元上表达标记了红色和绿色的钙离子敏感荧光蛋白R-GECO1与G-GECO1.2，然后让环境中的NaCl浓度以10秒为周期在0mM和50mM之间切换。通过分析两个神经元内钙离子的浓度变化，可以看出两个神经细胞两者在NaCl不同浓度下的相反表现。扩展阅读：GCaMP钙离子成像中，视网膜上两个神经细胞表现出相反的钙离子浓度变化（A浓度高的时候B浓度低，B浓度变高时A浓度下降），如何采用Reslice方法在平面图中反映出这种关系，敬请参阅链接中文章第14-16步：点击进入了解>>

W-View GEMINI应用实例4——心肌细胞搏动时钙离子浓度的变化与细胞收缩在时间上的先后分析

除了两个不同颜色的荧光同步成像之外，W-View GEMINI还可以用于荧光和明场的同步成像。在这个例子中，研究者同步拍摄监测了心肌细胞波动时的钙离子浓度变化以及细胞收缩的情况。蓝光激发发绿色荧光的Fluo-8被用于钙离子浓度的监测，而明场的相差（phase contrast）成像则是采用了600-680nm的红光。通过对单个细胞中钙离子浓度和相差图像的分析，可以看出钙离子的浓度上升是稍稍领先于心肌细胞的收缩的。

这一类实验中，明场透射光的信号是比荧光信号强很多的，除了可以在明场透射光光路中加入减光片将两个信号调整得差不多之外，更方便的方法是利用Flash 4.0 LT可以针对芯片两半分别调整曝光时间的特点进行更加灵活的调整（参考本文相关段落：双色同步成像——一台Flash 4.0 LT相机作两台用）。

W-View GEMINI应用实例5——斑马鱼双色双光子lightsheet成像

在国内，北京大学的研究者也采用W-View GEMINI在他们自己设计搭建的双色双光子lightsheet成像系统中。系统采用两台飞秒激光器作为光源分别双光子激发两个颜色的荧光探针，进行双色的3维lightsheet成像。样品是3天大小的斑马鱼，红色和绿色的荧光探针分别标记着红细胞和胰岛细胞，为了能够尽可能缩短3维图像的采集时间，以防红细胞在血管中的移动影响成像质量，系统中采用了W-View GEMINI进行了双色的分光，让Flash 4.0 V2相机同步对红细胞和胰岛细胞进行成像。