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拉曼光谱原理

#拉曼散射过程



拉曼散射是基于光子与分子中的电子云及分子键结的相互作用[图1(a)]。对于自发拉曼效应,光子将分子从基态激发到一个虚拟的能量状态。当激发态的分子放出一个光子后并返回到一个不同于基态的旋转或振动状态。在基态与新状态间的能量差会使得释放光子的频率与激发光线的波长不同。


入射的激光可以表达为:


公式 1



其中ω为分子振动的频率


则分子的诱导电偶极矩可以表达为:


公式 2



其中α为分子极化率


由于分子的振动,原子核的位置可以表达为:


公式 3



其中ν为分子的振动频率


分子的极化率与分子的原子核的位置有关。可以表达为:


公式 4



因此诱导偶极矩可以进一步表达为:


公式 5



把方程1带入方程5,可以得到:


公式 6



光经过样本产生的散射与P成正比。所以从P我们就可以直接得到散射光谱的组分。


第一项为瑞丽散射,散射光子的频率与入射光子的频率相同。


第二项与第三项统称为拉曼散射,散射光子的频率与入射光子频率不同,频率的差等于分子的振动频率。其中第二项为斯托克斯散射,当分子与入射光子作用时,分子处于基态,在发生拉曼散射以后,分子在入射光作用下激发到振动激发态。因此斯托克思散射光子的频率低于入射光子的频率。而第三项对应的是反斯托克斯拉曼散射,当分子与入射光子作用时,分子处于振动激发态,当发生拉曼散射以后,分子回到基态。分子振动的能量转移到散射的光子上,因此,反斯托克斯光子的频率高于入射光子的频率。图1(b)展示了瑞丽散射与拉曼散射的能级图。


图1 (a)拉曼散射与瑞丽散射 (b)拉曼散射、瑞丽散射与红外吸收的能级图



拉曼信号十分微弱,大概每10E7~10E8个入射的光子,只有1个光子发生拉曼散射过程[1]。因而拉曼光谱技术对于探测器的灵敏度有较高的要求。此外拉曼散射信号的强度是与散射光波长的四次方成反比。



#拉曼光谱的信息



由于分子内一般会有多个分子键,每个分子键也会有多种振动模式(伸展,摆动,剪式运动等)。不同分子键的不同的振动模式的振动频率不同,因而分子的拉曼光谱是一个多峰的光谱。图2是老鼠骨头的拉曼光谱[2],可以看到分子内不同的化学键可以在拉曼光谱中清楚的区分开来。


图2 老鼠皮质骨拉曼光谱



拉曼峰的强度正比于激发区域内被激发的分子键个数,此外拉曼光谱的峰值与强度还受到环境因素的影响。因此从拉曼光谱中,我们可以得到分子的种类与浓度,样本所受到的压力以及样本的相与形态等信息。


拉曼光谱图的坐标横轴单位一般是波数(cm-1),是通过1/拉曼信号波长-1/激发光波长然后将单位换算为cm-1得到的。比如785nm激发时,1010.22nm的拉曼信号对应着2840cm-1的拉曼光谱。


#拉曼光谱的优缺点



拉曼光谱的峰宽度FWHM可以窄达4cm-1(0.3nm)[3],因而相比于光谱宽度很宽的荧光光谱(~30nm)有更好的特异性,从光谱本身就有可能得到分子组分,分子振动的信息。拉曼光谱的窄光谱特性还使其更适合进行多组分分析。拉曼光谱信号完全是来自于样本分子振动本身,不需要对样本进行染色等预先处理,因而适合无损的、活体的检测实验。与另外一种经常用于探测分子振动的技术-红外光谱技术相比,由于拉曼光谱技术的激发光一般在可见光与近红外,因此拉曼光谱技术不像红外光谱技术一样容易受到水的影响,因而更适合用于溶液探测,含水的样本探测。


不过拉曼信号十分微弱,相比于瑞丽散射弱107倍,相比于荧光蛋白的荧光信号也弱了有105-106倍。因而拉曼光谱技术对于探测器的灵敏度,信噪比有很高的要求。此外,对于生物样本,拉曼信号常常是叠加于较强荧光信号之上的,为了减少荧光信号的影响,常采用785nm光进行激发[4],而此时拉曼信号的波长就会覆盖到~1000nm。因而生物拉曼系统中,对于探测器的动态范围,近红外的响应也有较高的要求。下面表格总结了三种最常见的光谱技术:拉曼光谱,红外光谱,荧光光谱技术的对比。


【参考文献】


[1] Petry R, Schmitt M, Popp J. Raman spectroscopy--a prospective tool in the life sciences.[J]. Chemphyschem A European Journal of Chemical Physics & Physical Chemistry, 2003, 4(1):14.


[2] Mandair G S, Morris M D. Contributions of Raman spectroscopy to the understanding of bone strength.[J]. Bonekey Reports, 2015, 4:620.


[3] Winefordner J D. Raman Spectroscopy for Chemical Analysis[M]. Wiley-Interscience, 2000.


[4] Hanlon E, Manoharan R T, Shafer K, et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy.[J]. Physics in Medicine & Biology, 2000, 45(2):R1.


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