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拉曼光谱技术系统

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王梓（wz@hamamatsu.com.cn）

常见的拉曼光谱系统主要分为四个组成部分：

1. 激发光源（激光）

2. 样品激发与信号收集部分

3. 波长选择部分

4. 探测器

根据波长选择部分的不同，拉曼光谱技术可以分为两个类型[图3]：1.基于色散的拉曼光谱系统。2.基于傅里叶变换的拉曼光谱系统（FT-Raman）[1]。对于前者，探测的拉曼信号通过光栅等分光器件进行分光，然后使用ccd，二极管阵列同时探测不同波长的拉曼信号。对于后者，探测器使用的是PMT，APD等点探测器，得到的原始信号是拉曼信号经过迈克尔逊干涉仪的信号，拉曼光谱是通过对干涉信号的傅里叶变换得到的。因为FT-Raman测量光谱时间很长，需要~30分钟。因而现在主流的拉曼设备是基于色散的拉曼光谱系统。

图 1 拉曼光谱系统的分类与基本组成部分（a）色散型拉曼系统（b）傅里叶变换拉曼系统

下面将描述色散类拉曼光谱系统的各个组成部分的技术要求。

#激发光源

由于拉曼信号比较微弱，因此为了得到可以探测的拉曼光谱，激发光源需要使用激光器。在20年前，氩气和氪气离子激光器是主要使用的激发光源。近些年来，随着半导体激光器技术的发展，一些工作波长是近红外的半导体激光器也成为了主流。根据激发波长的不同，激发光源可以分为三个类型[1]，他们都有自己的优缺点。

1. 紫外光源，波长是244 nm，257 nm，325 nm，364 nm

2. 可见光光源，457 nm，488 nm，514 nm， 532 nm，633 nm，660 nm

3. 近红外光源，785 nm，830 nm，980 nm，1064 nm。

紫外光的光源通常是使用氩离子激光器。在紫外光激发的条件下，分子可以到电子激发态，从而实现共振拉曼激发，这可以显著的提高拉曼的信号强度。此外，紫外激发时（＜270nm），拉曼光谱与荧光光谱在不同的波长范围，因此紫外拉曼可以消除荧光的影响。紫外激发可以与蛋白质，DNA，RNA等生物样品产生特定性的拉曼增强，从而可以实现对样本特定结构的分析，而是用可见光是无法实现的[2]。此外，由于紫外光在半导体的穿透深度一般是几个纳米，因而紫外拉曼可以用来对样品表面的薄层（常见于新型硅基材料SOI材料)。

但是因为紫外光束看不见，并且紫外激光器相对更大型、更复杂，也更加昂贵，目前紫外拉曼实验依然属于高端技术，需要高水平专业技术人员操作。此外由于紫外光子的能量更高，在紫外激光照射下样品更易于烧坏或者降解，生物样本也更容易产生变异[3]。

可见光激光器通常为二极管激光器，532nm激光器通常为半导体激光器泵浦的固态激光器（DPSS）激光器。相比于紫外光激发的拉曼系统，可见光拉曼系统的激发光源体积小巧，价格便宜。对于镜片、探测器等也没有特别要求。对样本也不容易产生损伤。此外，虽然相比紫外拉曼信号较弱，但是相对于近红外激发，由于信号波长较短，所以可见光拉曼信号强度仍然较高[1]。

但是在可见光范围，生物样本、有机样本会产生较强的荧光，因此可见光激光器通常用于测试无机物样本。对于有机物与生物样本，一般使用近红外激光器激发。

近红外激光器通常为二极管激光器，其中1064nm激光器通常为Nd:YAG激光器。相比于基于可见光的拉曼系统，近红外激光器激发样本产生的荧光信号会小很多[图4][4]。此外近红外激光的穿透深度比可见光大，因此近红外拉曼系统经常用于生物样本与有机样本的研究。

图 2 不同激发光波长下荧光背景对比，波长越长，荧光背景越小

不过因为拉曼信号强度与拉曼散射的波长的四次方成反比，因而使用近红外激发时，拉曼信号相比使用可见光与紫外光激发的时候，会弱很多。此外拉曼信号波长达到了1000nm，在这个区间，普通的ccd信噪比较低，因而需要使用特别的CCD，比如深度耗尽类CCD。

#样品激发与信号收集部分

拉曼系统中，激发光一般是使用光纤传输或者是使用物镜/透镜汇聚到样本之上，然后再使用光纤或者透镜收集产生的拉曼信号，然后传输到光谱仪中分光被探测器探测。具体不同的样品激发与收集构型可以参见第四章。

#波长选择部分

色散类拉曼系统，也主要分为两种类型，一种是使用单色仪+PMT,另外一种是使用多色仪+CCD[3]。然而单色仪+PMT系统需要扫描光栅来探测不同波长的拉曼信号，因而探测一个完整的拉曼光谱需要较长的时间。而随着半导体技术的发展，CCD现在也具有较高的灵敏度和信噪比，因此使用多色仪+CCD成为了主流的拉曼系统类型[图5]。由于常见的拉曼光谱峰宽度在~20cm-1[5]，因而要求多色光谱仪分辨率至少好于10cm-1。此外拉曼光谱一般分布在500-1800cm-1，这个区域一般被称为指纹区域，因此要求设计光栅使CCD可以探测这个区域的信号。

图 3 基于多色仪与CCD的探测系统

#探测器

由于拉曼信号十分微弱，因此对于CCD的灵敏度有较高的要求，因而通常使用背照式的CCD提高量子效率。而为了能探测785nm激光激发的信号，需要探测器在1000nm附近有较好的相应，因此需要使用深度耗尽类CCD[图6]。此外，为了降低暗噪声的影响，通常需要对ccd进行降温。

图 4 不同类型CCD的量子效率曲线。背照式CCD显著的提高了量子效率。深度耗尽类CCD提高了近红外的响应

#拉曼信号处理方式

拉曼光谱包括了许多拉曼峰，每个拉曼峰的主要信息包括峰值的位置，宽度，强度。为了能够从拉曼光谱中获取更多的信息，需要对拉曼光谱进行进一步的处理。首先是先对拉曼光谱进行去除荧光，光谱仪强度响应矫正，波长标定等，得到波长，峰值均为准确的拉曼光谱。然后对于拉曼光谱可以进行以下三种处理[图7]

图 5 拉曼光谱的三种处理方式

1. 直接观察拉曼光谱峰高度，光谱位置的变化，分别可以得到分子浓度，分子结构的变化。比较适合进行定性的分析，比如研究不同疾病的生物组织的组分变化[6]。

2. 首先采集含有足够大样本的光谱库，然后在获取新的样本信号时可以进行分类算法，判断出未知样本属于光谱库里的哪个样本。从而可以实现样本识别，疾病诊断等等。常见的分类算法包括了PCA-LDA，PLS-DA等[7]。

3. 由于拉曼信号强度与分子的浓度呈正比。因此混合物的拉曼光谱可以认为是各个组分的拉曼光谱以其浓度为权重的叠加。因而使用线性分解，MCR-ALS等算法可以得到混合物中各个组分的浓度，这种方法常用于显微拉曼系统中[8]。

【参考文献】

[1] Hanlon E, Manoharan R T, Shafer K, et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy.[J]. Physics in Medicine & Biology, 2000, 45(2):R1.

[2] Fodor S P A, Rava R P, Hays T R, et al. ChemInform Abstract: ULTRAVIOLET RESONANCE RAMAN SPECTROSCOPY OF THE NUCLEOTIDES WITH 266-, 240-, 218-, AND 200-NM PULSED LASER EXCITATION[J]. Chemischer Informationsdienst, 1985, 16(30).

[3] Petry R, Schmitt M, Popp J. Raman spectroscopy--a prospective tool in the life sciences.[J]. Chemphyschem A European Journal of Chemical Physics & Physical Chemistry, 2003, 4(1):14.

[4] https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=11871

[5] Huang N, Short M, Zhao J, et al. Full range characterization of the Raman spectra of organs in a murine model[J]. Optics Express, 2011, 19(23):22892-909.

[6] Bergholt M S, Zheng W, Ho K Y, et al. Fiberoptic Confocal Raman Spectroscopy for Real-Time In Vivo Diagnosis of Dysplasia in Barrett's Esophagus[J]. Gastroenterology, 2014, 146(1):27-32.

[7] Singh S P, Deshmukh A, Chaturvedi P, et al. Raman spectroscopy in head and neck cancers: toward oncological applications[J]. Journal of Cancer Research & Therapeutics, 2012, 8 Suppl 1(Suppl 1):S126.

[8] Lu F K, Basu S, Igras V, et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(37):11624-9.

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