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表面增强型拉曼


拉曼信号十分的微弱。为了让拉曼技术更加方便易用,许多研究者致力于研究如何增强拉曼信号。拉曼信号增强主要是通过改变样本制备方式,更改激发方式来实现的,以下是几种常见的增强型拉曼技术。


#表面共振增强型拉曼(SERS)



SERS是一种非常灵敏的探测技术,它能够显著的增强微弱的拉曼信号,允许在极低的样品浓度下探测样品的存在、结构等。SERS使用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品,或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。SERS现象首先是由英国科学家Fleischmann在1974年发现的[1],当时他发现吸附在粗糙的银电极表面的吡啶拉曼信号增强。1997年学者Kneipp与Nie成功的实现了单分子级别拉曼探测[2,3],从此SERS成为了非常流行的探测技术。 SERS能够提高拉曼信号主要是有两个机制,一是电磁场增强,一个是化学增强[图7]。电磁场被认为是最主要的增强贡献,当激光入射到金属纳米颗粒的时候,会发生等离子效应,在纳米颗粒周围的电场会显著增强,因而附着在纳米颗粒表面的待测分子的拉曼信号就会因此显著提高。电磁场增强效应可以提高拉曼信号约1万倍[4]。由于Cu, Ag和Au 3种IB族金属的d电子和s电子的能隙和过渡金属相比较大, 在可见光与近红外激光激发的情况下,它们不易发生带间跃迁。便可避免因发生带间跃迁而将吸收光的能量转化为热等, 从而趋向于实现高效SPR散射过程。因而Cu, Ag和Au是目前最主要使用的SERS基质金属。对于化学效应,待测分子与金属发生了电荷转移,从而更改了待测分子的能级结构,可以实现共振激发,提高拉曼信号。化学效应可以提高拉曼信号约10-100倍[4]。


图 1 SERS的增强原理



由于SERS技术可以显著的提高拉曼信号的强度,因而SERS技术对于激发光源,探测器的要求就会大幅度降低。这使拉曼设备的小型化成为了可能。如下图是滨松生产的SERS模块C13560,它的尺寸只有80*60*12.5mm3,重量只有80g,相比于其它重达几十千克的科学拉曼设备,C13560具有非常高的便携性,非常适合那些对便携性要求高的场合,比如毒品检测,污水检测等。


图 2 滨松C13560-基于SERS的超轻便手持型拉曼设备



SERS技术的核心关键就是SERS基质的制备。SERS基质的主要问题包括有信号增强不均匀,基质寿命短,成本高等缺点。因此目前SERS基质发展主要是有两个方向:1是提高增强的均匀性。2是降低成本,降低基质制备要求与制备时间,实现基质的立等可取。对于前者,目前采用的主要手段是纳米印刷技术,可以实现金属纳米颗粒高度均匀的分布,从而可以实现高度均匀的拉曼增强,此外介质的寿命也可以做到长达半年[4]。对于后者目前主要的手段分为两种[5],一种是采用打印技术,将纳米颗粒溶液放到打印机的墨盒中,可以将纳米颗粒打到印到纸张上,可以非常高效率的完成SERS基质的制备。还有一种是基于电流位移的技术。在金属片比如铝片上涂上还有银离子的溶液,铝会把银离子还原,从而银就以比较粗糙的形式附着在了金属片上。这两种制备方法都具备实验条件要求低,成本地,速度快,立等可取的优点。从另外一个角度解决了SERS寿命短的问题。


图 3 三种SERS基质制备技术的对比


#针尖增强拉曼技术(TERS)



TERS实际上也是基于表面等离子增强效应。不过与SERS不同,TERS并不是使用粗糙的金属基质来增强拉曼信号,而是使用一根靠近样品的极细的金属针尖来增强针尖附近的拉曼信号。


TERS技术一般是基于原子力显微镜搭建的。通过将原子力显微镜(AFM)的针尖包覆SERS活性金属或金属纳米粒子(Ag, Al, Au等)使其具有SERS活性,那么SERS增强效应将可望只在针尖附近很小范围发生。TERS实验通常需要将激发激光束通过标准的显微镜物镜聚焦,从而产生在衍射极限0.5 ~ 1.0微米范围内尺寸的光斑(具体大小依赖于激发激光波长和所使用的物镜);然后使具有SERS活性的针尖与激光光斑范围内的样品接触。


这里主要有两种类型的拉曼散射过程[6]:


来自衍射极限0.5 ~ 1.0微米激光光斑范围内的常规拉曼散射。


来自针尖的表面增强拉曼散射(即针尖增强拉曼散射)。


由于SERS给出的拉曼强度增强可高达1014-1015倍,那么TERS强度可以认为远超过常规拉曼信号强度。因此可以认为拉曼信号仅仅来自于针尖附近的样本。因此在光斑范围内扫描针尖的移动,就可以得到光斑内的显微拉曼。由于针尖的尺度一般都小于100 nm,所以这种测量的空间分辨率也将相应地小于100 nm,从而实现真正纳米尺度的拉曼。当然,因为与常规拉曼分析相比,TERS所取样的分子数目相应地也减少了几个数量级,所以并不能保证所有的样本都可以成功的实现TERS。下图展示了TERS基本的实验构型与针尖的大小[7]。


图 4 TERS系统的基本结构



TERS可以具有可以实现单分子探测,具有很高的分辨率(<100nm)的优点,但是因为TERS一般需要与AFM相结合,系统比较复杂,因此应用一般局限在实验室中,而不能像SERS一样有机会发展为手持设备。此外TERS技术所用的针尖也容易损坏,表面镀的活性金属液容易脱落,进一步提高了TERS实验的难度。下图总结了TERS的优缺点 。


图 5 TERS技术的优缺点


# 共振拉曼增强(RRS)



共振拉曼光谱是常规拉曼光谱的一个变种,对于共振拉曼而言,需要仔细挑选激发波长,使得激光光子能量与某个电子跃迁的能量相等或者相近,一般而言位于紫外-可见吸收区域。这种共振将导致拉曼散射的强度增大102-106倍,因此,检测限会更低,测量时间也会显著减少。对于一些特殊的应用而言,共振拉曼的益处很多,一个典型的例子是利用共振拉曼来分析环境污染物,通常,共振拉曼可以检测到浓度低至ppm~ppb范围的微量污染物。


图 6 RRS的能级过程,分子被入射光激发到电子激发态



当激发光波长小于270nm的时候,分子会被激发到激发到电子激发态的高层态,然后当发生荧光时,分子会先通过非辐射跃迁弛豫到电子激发态的底层,再向下跃迁产生荧光。而对于拉曼过程,不存在由非辐射跃迁过程,因此拉曼信号的波长比荧光信号的波长短,因此可以使用滤光片有效的去除荧光信号的影响。此外,对于大生物分子,共振吸收通常会发生在大分子的某一个官能团,这里称之为发色团。因而RRS可以实现对大分子中某个发色团的研究而不被周围其他分子影响[8]。


不过由于RRS的激光光源一般是采用紫外光,所以对整个系统的玻璃材质,镀膜都会有特殊需求,所以相对成本较高,此外并且紫外激光器相对更大型、更复杂,也更加昂贵,目前紫外拉曼实验依然属于高端技术,需要高水平专业技术人员操作。最后由于紫外光子的能量更高,在紫外激光照射下样品更易于烧坏或者降解,生物样本也更容易产生变异[8]。下图是RRS的简要优缺点对比图 。


图 7 RRS技术的优缺点


# 相干拉曼散射技术(CRS)



与前面几种拉曼增强技术只使用一个波长激发不同,CRS技术需要使用两个波长的光源对样本进行激发。CRS也可以大概提高信号106倍,目前已经成为一种常见的非线性显微技术。


CRS分为两种类型,一种是相干反斯托克斯拉曼散射(CARS),另外一种是受激拉曼散射(SRS)[9]。在CRS技术中,两束频率分别为wp与ws的光在空间上重合然后通过物镜汇聚到样本上。当两束光的频率差与分子振动的能级相同的时候,就会发生CARS与SRS过程,对于CARS过程,两束光与样本相互作用,产生频率为2wp-ws的CARS信号。而对于SRS过程,两束光与样本相互作用,wp的能量会转移到ws光上。下图为CARS与SRS过程对应的能级图。


图 8 CRS的能级过程,与自发拉曼不同,CRS需要两束入射光



虽然CRS可以显著的提高拉曼信号强度,但是相比于普通荧光信号,受激界面仍然较弱,因而激光光源常采用飞秒、皮秒光源来提高收集效率。为了提高穿透深度,光源一般采用近红外光,所以掺钛蓝宝石飞秒激光器+OPO等超快光源是主流的CRS光源。


对于CARS技术,由于CARS信号仍然较微弱,所以产生的信号一般是经过滤光片滤除激发光以后直接使用PMT进行探测,由于CARS信号一般位于600-800nm区间,所以具有较好的可见与红外响应的多碱,GaAsP类型的PMT成为CARS技术的首选PMT,比如滨松的R3896,H7422p-40等[10,11]。


而对于SRS过程,由于SRS信号本身与激发光源的波长一致,所以无法使用PMT进行探测,为了能够实现探测,常采用的方法是基于调制器与锁相放大器的调制与解调方法。以使用816nm与1064nm激光探测生物样本中油脂的SRS实验为例[见下图]。使用电光调制器或者声光调制器调制1064nm激光的强度,调制频率为20MHZ,则由于SRS过程,在经过了样本之后,816nm的强度也发生了调制(有1064nm时,816nm强度减弱,没有1064nm时,816nm强度不变),调制的深度即为SRS信号的强度。经过带通滤波片使用光电二极管探测816nm信号,然后将二极管探测的信号输入到锁相放大器,就可以得到816nm的调制深度,从而得到SRS信号的强度[12]。


图 9 SRS技术的实验装置与SRS信号探测的方法



CRS技术非常适合用于显微成像,可以实现视频级的速度。不过由于CRS一次成像只是得到一个波数的图像,因此更适合那种拉曼峰特别明显的样本。如果想要得到与显微拉曼类似的数据(每个像素都包含有拉曼光谱),则需要扫描两束及发光的波长差,则CRS的时间优势会变得稍微不明显。下面是CRS技术的优缺点。


图10 CRS技术的优缺点



【参考文献】



[1] Fleischmann M, Hendra P J, McQuillan A J. Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode[J]. Chemical Physics Letters, 1974, 26(2): 163-166.


[2] Kneipp K, Wang Y, Kneipp H, et al. Single molecule detection using surface-enhanced Raman scattering (SERS)[J]. Physical review letters, 1997, 78(9): 1667.


[3] Nie S, Emory S R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering[J]. science, 1997, 275(5303): 1102-1106.


[4] Stiles P L, Dieringer J A, Shah N C, et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Annu. Rev. Anal. Chem., 2008, 1: 601-626.


[5] Betz J F, Yu W W, Cheng Y, et al. Simple SERS substrates: powerful, portable, and full of potential[J]. Physical chemistry chemical physics : PCCP, 2014, 16(6):2224-39.


[6] Gibson, K. F. and Kazarian, S. G. 2014. Tip-enhanced Raman Spectroscopy. Encyclopedia of Analytical Chemistry. 1–30.


[7] http://www.princetoninstruments.com/userfiles/files/appnotes/TERS_Tip-Enhanced-Raman-Scattering-APP_Note_RevA2.pdf


[8] Petry R, Schmitt M, Popp J. Raman spectroscopy--a prospective tool in the life sciences.[J]. Chemphyschem A European Journal of Chemical Physics & Physical Chemistry, 2003, 4(1):14.


[9] Cheng J X, Xie X S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.[J]. Science, 2015, 350(6264):aaa8870.


[10] Lin J, Lu F, Zheng W, et al. Assessment of liver steatosis and fibrosis in rats using integrated coherent anti-Stokes Raman scattering and multiphoton imaging technique.[J]. Journal of Biomedical Optics, 2011, 16(11):116024.


[11] Wang Z, Zheng W, Hsu C Y S, et al. Epi-detected quadruple-modal nonlinear optical microscopy for label-free imaging of the tooth[J]. Applied Physics Letters, 2015, 106(3):775.


[12] Freudiger C W, Min W, Saar B G, et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy[J]. Science, 2008, 322(5909): 1857-1861.


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